Клетки полагаются на сложные молекулярные машины, состоящие из белковых сборок, для выполнения важных функций, таких как производство энергии, экспрессия генов и синтез белка. Чтобы лучше понять, как работают эти машины, ученые делают их снимки, изолируя белки от клеток и используя различные методы для определения их структуры. Однако выделение белков из клеток также удаляет их из контекста их естественной среды, включая партнеров по взаимодействию белков и клеточное расположение.
Недавно криогенная электронная томография (крио-ЭТ) появилась как способ наблюдения за белками в их естественной среде путем визуализации замороженных клеток под разными углами для получения трехмерной структурной информации. Этот подход интересен, поскольку позволяет исследователям напрямую наблюдать, как и где белки связываются друг с другом, выявляя клеточное окружение этих взаимодействий внутри клетки.
Благодаря технологии, доступной для визуализации белков в их естественной среде, аспирант Массачусетского технологического института Барретт Пауэлл задался вопросом, сможет ли он сделать еще один шаг вперед: что, если бы молекулярные машины можно было наблюдать в действии? В статье, опубликованной 8 марта в Природные методыПауэлл описывает разработанный им метод, названный tomoDRGN, для моделирования структурных различий белков в данных крио-ET, которые возникают в результате движения белков или связывания белков с различными партнерами по взаимодействию. Эти различия известны как структурная неоднородность.
Хотя Пауэлл присоединился к лаборатории доцента биологии Массачусетского технологического института Джоуи Дэвиса в качестве ученого-экспериментатора, он осознавал потенциальное влияние вычислительных подходов на понимание структурной гетерогенности внутри клетки. Ранее лаборатория Дэвиса разработала похожую методологию под названием криоDRGN, чтобы понять структурную гетерогенность в очищенных образцах. Когда Пауэлл и Дэвис увидели, что крио-ЭТ становится все более популярным в этой области, Пауэлл взял на себя задачу переосмыслить эту структуру для работы в клетках.
При решении структур с очищенными образцами каждая частица визуализируется только один раз. Напротив, данные крио-ЭТ собираются путем визуализации каждой частицы более 40 раз под разными углами. Это означало, что tomoDRGN должна была иметь возможность объединять информацию из более чем 40 изображений, и именно здесь проект столкнулся с препятствием: объем данных привел к информационной перегрузке.
Чтобы решить эту проблему, Пауэлл успешно перестроил модель криоDRGN, отдав приоритет только данным самого высокого качества. При многократном отображении одной и той же частицы происходит радиационное повреждение. Таким образом, изображения, полученные ранее, имеют более высокое качество, поскольку частицы менее повреждены.
«Благодаря исключению некоторых данных более низкого качества результаты были на самом деле лучше, чем при использовании всех данных, а производительность вычислений была значительно выше», — говорит Пауэлл.
Когда Пауэлл начал работу над тестированием своей модели, ему повезло: авторы нового новаторского исследования, которое впервые визуализировало рибосомы внутри клеток с разрешением, близким к атомному, поделились своими необработанными данными по электрической микроскопии. Публичный архив изображений (EMPIAR). Этот набор данных стал образцовым тестовым примером для Пауэлла, с помощью которого он продемонстрировал, что tomoDRGN может выявить структурную неоднородность в данных крио-ЭТ.
По словам Пауэлла, одним из интересных результатов является то, что tomoDRGN обнаружил вокруг подмножества рибосом в наборе данных EMPIAR. Некоторые из рибосомальных частиц были связаны с мембраной бактериальной клетки и участвовали в процессе, называемом котрансляционной транслокацией. Это происходит, когда белок одновременно синтезируется и транспортируется через мембрану. Исследователи могут использовать этот результат для выдвижения новых гипотез о том, как рибосома функционирует вместе с другими белковыми механизмами, необходимыми для транспортировки белков за пределы клетки, теперь руководствуясь структурой комплекса в его естественной среде.
Увидев, что tomoDRGN может разрешить структурную неоднородность из структурно разнообразного набора данных, Пауэллу стало любопытно: насколько малую часть популяции можно идентифицировать tomoDRGN? Для этого теста он выбрал белок под названием апоферритин, который обычно используется в качестве эталона для крио-ЭТ и часто считается структурно гомогенным. Ферритин — это белок, используемый для хранения железа, и его называют апоферритином, когда ему не хватает железа.
Удивительно, но в дополнение к ожидаемым частицам tomoDRGN выявил незначительную популяцию частиц ферритина — со связанным железом — составляющих всего 2 процента набора данных, о чем ранее не сообщалось. Этот результат еще раз продемонстрировал способность tomoDRGN идентифицировать структурные состояния, которые возникают настолько редко, что их можно было бы усреднить из трехмерной реконструкции.
Пауэлл и другие сотрудники Лаборатории Дэвиса с нетерпением ждут возможности применения tomoDRGN для дальнейших исследований рибосом и других систем. Дэвис работает над пониманием того, как клетки собираются, регулируют и разрушают молекулярные машины, поэтому следующие шаги включают более детальное изучение биогенеза рибосом внутри клеток с использованием этого нового инструмента.
«Какие возможные состояния мы можем потерять во время очищения?» — спрашивает Дэвис. «Возможно, еще интереснее то, что мы можем посмотреть, как они локализуются внутри клетки и с какими партнерами и белковыми комплексами они могут взаимодействовать».